Poren-Bildungsmechanismus

Projektleiter: N. Hellmann
Mitarbeiter: H. Decker, M. Schwiering
Zusammenarbeit: Prof. S. Bhakdi, Dr. A. Valeva (Institut für Medizinische Mikrobiologie, Universitätsklinikum Mainz)
Förderung: SFB 490 “Invasion and Persistence of Infection“, Teilprojekt D4

Seit der Beschreibung des Staphylococcus aureus alpha-Toxins als erstes porenbildendes Toxin sind über 100 porenbildende Toxine identifiziert worden. Bei einigen konnten die Schritte zur Porenbildung im Detail charakterisiert und die dreidimensionale Struktur der Pore dargestellt werden. Trotz dieser Fortschritte sind eine Reihe von fundamentalen Fragen offen geblieben, von denen zwei in diesem Projekt angegangen werden sollen. (1) Bei der sogenannten RTX-Toxinfamilie – mit dem E. coli Hämolysin (HlyA) als Prototyp – konnte bislang nicht geklärt werden, ob die Pore durch ein Monomer oder durch ein Oligomer gebildet wird. Zur Zeit liegen uns Hinweise dafür vor, dass HlyA den Prototyp einer rasch verschließbaren, monomeren Pore darstellen könnte. (2) Bei den meisten Toxinen ist die Rezeptorfrage nicht geklärt. Eine Bindung der Toxine an Glykoprotein- oder Glykolipidrezeptoren würde topologische Probleme aufwerfen: die Toxine würden zunächst weit von ihrem Ziel entfernt gebunden sein, und Mechanismen für deren Translokation durch den Glykokalyx sind nicht bekannt. Alternativ wird von uns daher vorgeschlagen, dass hydrophile Kopfgruppen von Phospholipiden als niederaffine „quasi-Rezeptoren“ fungieren könnten und über eine sehr rasche Oligomerisierung der Toxine die Bildung einer stabilen, hoch-affinen Pore erfolgt. Als Modell verwenden wir das S. aureus alpha-Toxin. Um diese beiden Fragen zu klären, sollen „Stopped-Flow-Messungen“ durchgeführt werden, mit denen schnelle Prozesse erfasst werden können. Hierbei werden Fluoreszenz-markierte Toxin-Derivate eingesetzt. Durch die Wahl des Fluorophors kann bestimmt werden, welcher Teilprozess der Interaktion dominant die Änderung der Fluoreszenz bedingt. Acrylodan reagiert auf eine Änderung der Polarität der Umgebung, während Pyrene seine Fluoreszenz nur ändert, wenn ein zweites Pyrene-markiertes Molekül in der Nähe ist. Bindung und Aggregation können somit differenziert werden. Im Mainzer Toxin-Laboratorium sind geeignete, markierbare Mutanten des HlyA und des S. aureus alpha-Toxins hergestellt worden. Durch den Einsatz von FRET (Fluoreszenz-Energie-Transfer) kann die Kinetik der Oligomerisierung von S. aureus alpha-Toxin mit großer Präzision studiert werden. Sollte unsere These stimmen, werden Membranbindung und Oligomerisierung praktisch zeitgleich stattfinden. Im Gegenzug würde ein fehlender Fluoreszenz-Energietransfer bei HlyA die Monomer-These für dieses Toxin erhärten. Die Untersuchungen verlangen einerseits Expertise bei der Herstellung und Auswahl der geeigneten Toxinmutanten, andererseits die einschlägige Erfahrung mit Stopped-Flow-Messungen. Diese Konstellation ist in Mainz glücklicherweise gegeben.

Publikationen:

  • Meesters C, Brack A., Hellmann N., Decker H. (2009) Structural Characterization of the α-Hemolysin Monomer from Staphylococcus aureus Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics 75:118-126
  • Meesters C., Antje Brack A., Hartmann, H., Haramus V., Hellmann, N., Decker H (2008) SANS on the pre-pore state of the α-Toxin Staphylococcus aureus GeNF – Experimental Report 2007, p.53-54
  • Valeva A, Hellmann N, Walev I, Strand D, Plate M, Boukhallouk F, Brack A, Hanada K, Decker H, Bhakdi S (2006): "Evidence that clustered phosphocholine head groups serve as sites for binding and assembly of an oligomeric protein pore", J. Biol. Chem. 281:26014-21